Western-blot-实验原理和实验步骤

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摘要:Westernblotting基本原理和实验步骤为什么要做蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。Westernblot基本原理1蛋白免疫印迹的组成目录2Westernblot一般流程3Westernblot常见问题分析4WesternBlot基本原理1WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。组成蛋白免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的2印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到

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