基因敲除细胞系：如何设计gRNA高效KO-以及避免蛋白残留-—源井生物

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摘要:基因敲除细胞系：如何设计gRNA高效KO，以及避免蛋白残留——源井生物基因组编辑是一种理想的研究基因功能的方法。它可以精确地识别和定位基因组中的特定序列，然后改变目标序列以达到各种目的。CRISPR/Cas9系统由于其简单的机制已经成为当今世界基因组编辑的代名词。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常见的应用。在CRISPR/Cas9介导的基因敲除实验中，Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并产生双链DNA断裂（DSB）。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失（indels），引起移码突变，导致终止密码子提前，实现编码基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9实验中，gRNA的选择将很大程度上影响项目的成功率。在选择gRNA的时候，有几个因素可以帮助大家选取有效的gRNA以产生成功的敲除：1）预测gRNA效率；2）选择脱靶风险低的gRNA；3）同时使用多个gRNA以提高敲除效率。在编码基因敲除实验中，DNA水平验证KO结果是首要的，此外，蛋白质水平的验证也非常关键。蛋白水平的验证通常是通过WesternBlot实现的，但以下这两种现象，有可能导致截短蛋白仍然表达，从而致使WB验证时出现阳性情况。(1)基因产生移码突变后，下游ATG密码子有可能启动翻译，从而导致蛋白表达。或者位于移码突变上游的外显子翻译表达，产生N末端截短蛋白。(2)细胞跳过被编辑的外显子翻译表达，产生内部序列缺失的蛋白质异构体。图1:抗INDEL效应导致CRISPR基因敲除实验失败的细胞机制翻译重新启动CRISPR介导的基因敲除通常是通过Cas9产生dsDNA断裂来实现

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