Topo+TA+clone

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摘要:TopoTA克隆方法（TopoTACloningKit）TopoTA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而TopoTACloning用的是DNATopoisomerase。Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。TopoTA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。TopoTA克隆系统提供TopoisomeraseI载体，感受态细胞，SOC培养基等。Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（ZeroBluntTopoPCRCloningKit）（TopoXLPCRCloningKit）因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB（Controlofcelldeath）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNAgyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与TopoTA方法一样，操作简单快速。TOPOPCR表达克隆法传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白

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